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凱氏定氮儀是蛋白質(zhì)測定儀嗎？
作者：祎鴻儀器 點(diǎn)擊率： 發(fā)布時(shí)間：2017-11-29 21:41:00
測定蛋白質(zhì)含量的儀器有很多，如雙縮脲法、folin―酚試劑法、改良的簡(jiǎn)易folin―酚試劑法、考馬斯亮蘭法、紫外吸收法、凱氏定氮儀是其中的一種測量?jì)x器，他們之間的區別在于方法和適用性不一樣。我們一起來(lái)探討交流吧！
1、雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò )合物，稱(chēng)為雙縮脲反應。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應。
紫色絡(luò )合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。
2、folin―酚試劑法（lowry法）這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現在已可以訂購），近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin―酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結合生成復合物。folin―酚試劑中的磷鉬酸鹽―磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。
folin―酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應用。這個(gè)測定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費時(shí)間較長(cháng)，要精確控制操作時(shí)間，標準曲線(xiàn)也不是嚴格的直線(xiàn)形式，且專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線(xiàn)。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉―氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì )色淺，則必須提高碳酸鈉―氫氧化鈉溶液的濃度1～2倍。
進(jìn)行測定時(shí)，加folin―酚試劑時(shí)要特別小心，因為該試劑僅在酸性ph條件下穩定，但上述還原反應只在ph=10的情況下發(fā)生，故當folin一酚試劑加到堿性的銅―蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸―磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發(fā)生。也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。
3、改良的簡(jiǎn)易folin―酚試劑法a.試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含0.5n NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸鉀和0.05%硫酸銅，配制時(shí)注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后，最后加入。b.試劑乙：與前面的基本法相同。臨用時(shí)加蒸餾水稀釋8倍。c.標準蛋白質(zhì)溶液：同基本法。
4、考馬斯亮蘭法（bradford法），雙縮脲法（biuret法）和folin—酚試劑法（lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們去尋找更好的蛋白質(zhì)溶液測定的方法。1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法（bradford法），是根據蛋白質(zhì)與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法?？捡R斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。在595nm下測定的吸光度值a595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。
5、紫外吸收法：蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(cháng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。
紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH4）2SO4等和大多數緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續檢測，因為此時(shí)只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。
此法的特點(diǎn)是測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標準曲線(xiàn)法測定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì )出現較大的干擾。核酸的干擾可以通過(guò)查校正表，再進(jìn)行計算的方法，加以適當的校正。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過(guò)校正，測定的結果還是存在一定的誤差。
此外，進(jìn)行紫外吸收法測定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因ph的改變而有變化，因此要注意溶液的ph值，測定樣品時(shí)的ph要與測定標準曲線(xiàn)的ph相一致。
6、凱氏（kjeldahl）定氮法（最為經(jīng)典的方法之一）
樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應式如下：
NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 ――2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 (1)
2NH3 +H2 SO4 ――(NH4 )2 SO4 (2)
(NH4 )2 SO4 +2NaOH――2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 (3)
反應（1）、(2)在凱氏瓶?jì)韧瓿?，反應?）在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。
為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。實(shí)驗和計算方法這里從略。
計算所得結果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應將總氮量減去非蛋白氮即得。如進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以系數即得。
